酸性磷酸酯酶动力学性质分析
米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的测定
[原理]
在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax）。
底物浓度与反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示：
式中
v——反应速度；
Km——米氏常数；
Vmax——酶反应最大速度；
[S] ——底物浓度。
从米氏方程式可见：米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，米氏常数的单位就是浓度单位(mol/L或mmol/L)。
在酶学分析中，Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。Km与底物浓度、酶浓度无关，与pH、温度、离子强度等因素有关。对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。
测定Km、Vmax，一般用作图法求得。作图法有很多，最常用的是Linewaver-Burk作图法，该法是根据米氏方程的倒数形式，以1/v对1/[S]作图，可得到一条直线。直线在横轴上的截距为 -1/Km，纵截距为1/Vmax，可求出Km与Vmax。
[方法和步骤]
1、制作标准曲线
取9支
试管
，按0～8编号。
1～8号管分别加入0.1至0.8mL酚标准应用液，并用蒸馏水将各管体积补充至1.0mL，0号管中加入1.0mL蒸馏水。各管各加1mol/L碳酸钠溶液2.0mL和Folin-酚稀溶液0.5mL，摇匀后，35℃保温显色10分钟。以0号管作空白，在可见光分光光度计680nm波长处读取各管的吸光度A
680
。
整个操作过程见下表：
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
0
酚含量/μmol
0.04
0.08
0.12
0.16
0.20
0.24
0.28
0.32
-
0.4mmol/L酚标准应用液/mL
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
-
蒸馏水/ mL
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
1.0
1mol/L碳酸钠溶液/ mL
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Folin-酚稀溶液/mL
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
以酚含量(μmol)为横座标，以A
680
为纵坐标，绘制标准曲线。
2、测定Km、Vmax
取
试管
7支，按照0～6编号，空白管为0号。各管按下表加入不同体积5mmol/L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)，并分别补充0.2mol/L pH5.6乙酸盐缓冲液至0.5mL。35℃预热2min后，逐管记时加入酸性磷酸酯酶酶液0.5mL，摇匀，精确反应15min。各管反应时间到达后立即加入1mol/L碳酸钠溶液2mL，摇匀，再加入Folin-酚稀溶掖0.5 mL，35℃保温显色l 0min。0号管内最后加入0.5 mL酶液，其它操作与上述各管相同。冷却后以0号管作空白，在可见光型
分光光度计
680nm波长处读取各管的吸光度A
680
。
在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax）。
管号
1
2
3
4
5
6
0
磷酸苯二钠终浓度/ mmol×L
-1
0.5
0.75
1.0
1.25
1.50
2.50
5 mmol/L磷酸苯二钠/ mL
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.50
0.5
0.2mmol/L乙酸盐
缓冲液
/ mL
0.4
0.35
0.30
0.25
0.20
0
0
稀释酶液/ mL
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
(最后加入)
1mol/L碳酸钠溶液/ mL
2
2
2
2
2
2
2
Folin-酚稀溶液/mL
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
A
680
[结果与计算]
1、从酚标准曲线上查出各管A
680
相当的酚含量，计算各种底物浓度下的反应初速度v。
2、以1/v为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，求出Km和Vmax。